摘要：為了探明蘭州百合小鱗莖的生長及膨大規(guī)律，以添加不同濃度蔗糖處理為依據(jù)，明確小鱗莖生根膨大培養(yǎng)基以1/2MS+0.2 mg/L NAA +70 g/L蔗糖為最適。在此濃度基礎上對蘭州百合試管小鱗芽進行1次和2次膨大培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)30、50、70、90 d時測定小鱗莖鮮重、干重、糖及淀粉含量。結果表明，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，蘭州百合1次和2次膨大小鱗莖單粒鮮重和干重均呈增加趨勢，且2次膨大較1次膨大效果顯著。1次膨大小鱗莖可溶性糖、果糖和淀粉含量均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加呈先增加后降低的趨勢，且變化趨勢基本一致;蔗糖含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈上升趨勢，與培養(yǎng)30 d相比，培養(yǎng)50～90 d時蔗糖含量明顯增加，且達極顯著差異。隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，2次膨大小鱗莖可溶性糖和蔗糖含量變化趨勢較平緩，各培養(yǎng)時期差異不明顯;果糖含量呈降低趨勢，與培養(yǎng)30 d相比，培養(yǎng)50～90 d時果糖含量顯著降低;淀粉含量呈增加趨勢，在培養(yǎng)90 d時達最大值。

　　關鍵詞：蘭州百合;試管小鱗莖;膨大;碳水化合物

　　蘭州百合(Lilium davidii var.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium) 川百合的變種，為多年生鱗莖草本植物，其鱗莖具有營養(yǎng)和滋陰養(yǎng)肺等功效，是我國食用百合中唯一的甜百合。百合在甘肅已有400多年的栽培歷史，因其兼具一定的藥用價值，被國家衛(wèi)生部確定為“藥食同源”植物，也是甘肅省重要的地理標志產(chǎn)品和重要的名優(yōu)特農(nóng)產(chǎn)品之一[1 - 3 ]。長期以來，蘭州百合主要以分球繁殖、珠芽和鱗片扦插等無性繁殖方式為 主[4 ]，長期采用易感染病害，造成種性退化，嚴重影響百合的產(chǎn)量和品質(zhì)。利用組織培養(yǎng)技術可有效地提高種苗種球繁殖系數(shù)，且操作簡便，同時還可以保持優(yōu)良的性狀，防止植物病毒的危害，在無性繁殖作物中廣泛應用。

　　百合的鱗莖是地下莖及其腋芽肥大而形成的變態(tài)器官[5 ]，具有繁殖和營養(yǎng)雙重作用，其形成與膨大是個復雜的生理過程[6 ]。碳水化合物的變化與百合鱗莖的發(fā)育有著密切的關系[5 ]，其中蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物，存在于許多果實中，它不僅是糖積累的主要方式，更是影響品質(zhì)形成的重要因子[7 ]。糖既可以直接作為基質(zhì)調(diào)節(jié)代謝，也可以作為有效的信號分子，所以糖的可利用性對植物的生長發(fā)育有著關鍵的驅(qū)動作用[8 - 9 ]。Jia等[10 ]研究發(fā)現(xiàn)，果實的生長和發(fā)育與糖濃度變化有著緊密的聯(lián)系，糖濃度增加時，可誘導ABA的積累，從而加速果實的成熟。淀粉是百合鱗莖細胞內(nèi)碳水化合物的主要貯藏形式[11 - 14 ]，其代謝作用直接關系到鱗莖及植株的發(fā)育[15 - 16 ]。目前關于蘭州百合試管小鱗莖形成過程中物質(zhì)累積、糖及淀粉含量變化規(guī)律的研究相對較少，我們利用組織培養(yǎng)技術，采用生長分析法研究小鱗莖生長膨大過程中生物量累積、糖及淀粉含量變化，以進一步了解蘭州百合種球的形成及膨大機理，為調(diào)控百合鱗莖的生長發(fā)育及膨大規(guī)律提供技術支撐。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　蘭州百合種球于2018年1月在蘭州市七里河區(qū)西果園鎮(zhèn)百合試驗田采集，選用外形飽滿、顏色潔白、健壯無病蟲害的3年生蘭州百合鱗莖。試驗于2018年3月至2019年12月在甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所實驗室進行。

　　1.2 試驗方法

　　將蘭州百合外層鱗片剝?nèi)ィx取中內(nèi)層鱗片，用流水沖洗6～8 h，濾紙吸干水分，然后在超凈工作臺上用無菌水沖洗3～5次，用70%乙醇消毒30～40 s，投入0.1%升汞溶液中消毒8～10 min，再用無菌水沖洗5～6次，置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中晾干水分。用解剖刀將鱗片分上中下3部分，切成0.5 cm×0.5 cm左右的外植體，接種于芽誘導培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L+30 g/L蔗糖)中。在(25±2) ℃、2 000～3 000 lx光照12～16 h條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)30～35 d 后將誘導出的不定芽切下接種至增殖培養(yǎng)基(MS+1.25 mg/L6-BA+0.2 mg/L+30 g/L)中擴繁，然后將叢生苗分單株切下接種到生根膨大培養(yǎng)基(1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+70 g/L蔗糖)中培養(yǎng)(每瓶裝50 mL的培養(yǎng)基)。接種60瓶(其中30瓶進行1次膨大測定用，其余30瓶1次膨大90 d后轉(zhuǎn)接到新的生根膨大培養(yǎng)基中，進行2次膨大培養(yǎng))，每瓶接種10個小鱗芽，定期(30、50、70、90 d)采集樣品(小鱗莖)，用直尺測定根長，采用稱重法測定小鱗莖鮮重，采用烘干法測定小鱗莖干重[2 ]。

　　1.3 測定方法

　　1.3.1 可溶性糖含量測定 采用蒽酮比色法測定[17 ]。準確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL濃度為200 μg/mL 的蔗糖標準溶液于7 支刻度試管中，加蒸餾水至2.0 mL，依次加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試液、5 mL 濃硫酸，經(jīng)渦旋振蕩后，置沸水浴中逐管準確保溫1 min，取出并自然冷卻至室溫后，以空白為對照，測定其在630 nm 處的吸光值，以蔗糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲，并求出標準曲線方程。

　　稱取烘干的百合鱗片粉末0.2 g，放入刻度試管中，加入10 mL蒸餾水，沸水中提取30 min，提取液用漏斗過濾(反復漂洗殘渣)，上清液最終定容至25 mL的容量瓶中即為可溶性糖提取液，每處理重復提取3次。吸取樣品提取液0.5 mL，加入1.5 mL H2O、0.5 mL的蒽酮，再緩慢加入5 mL濃H2SO4，蓋上試管塞后輕輕搖勻，然后打開試管塞置沸水浴中煮沸1 min，取出冷卻至室溫，在630 nm下測OD值，以0濃度管調(diào)零。查標準曲線得到提取液可溶性糖含量，計算樣品中的可溶性糖含量。

　　1.3.2 蔗糖含量測定 參照張志良[18 ]的方法測定。取蔗糖標準液用80%乙醇稀釋成0、10、20、30、40、60、80、100 μg/mL濃度的溶液，分別取0.4 mL溶液，各加入200 μL的濃度為2 mol/L NaOH溶液，100 ℃煮沸5 min，冷卻，再加入2.8 mL 30% HCl和0.8 mL 0.1%間苯二酚，搖勻，80 ℃水浴10 min，冷卻后在480 nm下測定OD值，以0濃度管調(diào)零。以蔗糖濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲，并求出標準曲線方程。

　　稱取烘干的百合鱗片粉末50 mg，放入10 mL刻度離心管中，加入4 mL 80%乙醇，置于80 ℃水浴中不斷攪拌40 min，離心，收集上清液，其殘渣加2 mL 80%乙醇重復提2次，合并上清液。在上清液中加入10 mg活性炭，80 ℃脫色30 min，80%乙醇定容至10 mL，重復3次。吸取樣品提取液0.4 mL，加入2.8 mL 30%HCl和0.8 mL 0.1%間苯二酚，然后搖勻，80 ℃水浴反應10 min，冷卻至室溫，在480 nm下測定OD值，以0濃度管調(diào)零。查標準曲線得提取液中總的蔗糖含量，計算樣品中的蔗糖含量。

　　1.3.3 果糖含量測定 稱取標準果糖溶液用80%乙醇稀釋成濃度0、15、30、50、75、150、200 mg/mL的溶液，取小試管8支，分別加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度的標準果糖溶液，各加入2.0 mL 0.1%間苯二酚及1.0 mL H2O，搖勻。80 ℃水浴反應10 min，冷卻至室溫，用分光光度計在480 nm處測定光密度OD值，以0濃度管調(diào)零。以果糖濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲，并求出標準曲線方程。