【關鍵詞】膜片鉗系統;微電極拉制儀;儀器設備;使用規范

　　一、膜片鉗技術的工作原理

　　膜片鉗技術是用于了解離子通道行為的通用型電生理工具，首先用微玻管電極(膜片電極或膜片吸管)接觸細胞膜，然后以千兆歐姆以上的阻抗使電極尖端與細胞膜封接，通過吸破或者電破的方式使與電極尖開口處相接的細胞膜的小區域與其周圍區域在電學上分隔，然后細胞膜破裂，進而對此區域上的離子通道的離子電流進行監測記錄的方法。該方法廣泛應用于神經細胞，肌纖維細胞，心肌細胞及高表達單一通道的卵母細胞。主要用于監測離子通道在正常或者疾病狀態下如何表現，以及不同藥物、離子或其他分析物如何改變這些狀態。

　　膜片鉗技術的建立，對生物科學特別是神經科學是一項具有重大意義的變革。這是一種通過離子通道記錄的離子電流來反映細胞膜單一的(或多個)的離子通道活動的技術。該技術的出現將生理學的細胞水平和分子水平聯系在一起，又將神經科學的不同亞科融匯在一起，促進了各個學科之間的聯系，加速了我們神經科學的研究進展，深入探討神經活動的機制研究。

　　二、膜片鉗技術操作方法

　　實驗前準備：打開總電源及穩壓電源，打開電腦、放大器，并開啟程序軟件patchmaster，新建數據文檔并準備開始試驗;用P97微電極拉制儀拉制玻璃電極若干備用;檢查減震臺的減震效果，打開倒置顯微鏡，監視器和微操備用;取一皿細胞將其中玻片取出放入小培養皿中，置于倒置顯微鏡下，于低倍鏡下尋找狀態良好的細胞，并轉入高倍鏡下再次確認細胞狀態及貼壁情況等;確認細胞后，取電極一根充灌電極內液，彈出氣泡，然后套入銀絲并插入探頭中扭緊旋鈕，用注射器管道給電極一點點正壓，將電極入水;入水后，查案入水電阻，要在4-8M左右的電極才可以使用，通過調節微操，使電極不斷向下接近細胞，待電極尖端逐漸變清晰并且將要接近細胞時停止向下，然后把電極移到細胞上方，調節放大器上的調零旋鈕以保證基線在零水平。

　　開始封接：調低微操步進速度，使電極尖端慢慢向細胞靠近，如發現基線方波突然變小，封接電阻上升時，即停止電極下降，通過注射器給電極負壓，封接成功的可見方波很快變小，電阻升至G歐。此時，調節快電容補償按鈕，將快電容電流補償掉，如封接穩定后，準備破膜。

　　破膜：在鉗制電位水平- 60mV時，漏電流<20pA，給予比較大的負壓(也可根據情況使用ZAP電破方式破膜)，將要破膜時可見基線上下浮動，破膜后，可見基線前后有兩個較大的慢電容電流。此時需要觀察操作程序上漏電流數值，如果超過50pA，表明漏電流很大，此細胞不能繼續實驗。如漏電流正常(小于20pA)則繼續以下實驗：調節慢電容(c-slow)與快電容(c-fast)補償按鈕，將慢電容電流也補償掉。同時觀察破膜電阻Rm(正常500M-1G)、串聯電阻Ra(正常5M-15M)，記錄膜電容值。設置濾波頻率為3.9KHz，采樣頻率為25-50KHz，要求漏電流小于20pA。

　　電壓鉗模式記錄：在全細胞記錄模式( whole-cell)下，為了讓電極內液和細胞內液充分交換，以達到穩定細胞狀態的目的，我們需要靜待幾分鐘。細胞穩定后，在電壓鉗的模式下，給予- 60mV-60mV的電壓刺激，便可觀察到細胞總的內向和外向電流，結合內向和外向流的大小，就可初步判斷細胞的興奮水平，判斷細胞狀態、封接的好與壞、電容補償是否符合要求。

　　電流鉗模式記錄：將記錄模式轉換到電流鉗模式( c-lamp)下，把鉗制電流數值改為“0”，可在程序軟件上觀察到靜息膜電位數值( Resting Membrane Potential，RP)，記錄膜電位數值大小，正常神經細胞靜息膜電位在50-60V。記錄動作電位：神經損傷、炎癥下或者神經增敏下，初級感覺神經元的興奮性會發生改變，一般采用300ms波寬標準記錄參數。

　　神經元興奮性記錄：神經元的興奮性主要是通過描述神經元的細胞膜特性表示。神經元細胞的膜特性包括主動膜特性和被動膜特性。主動膜特性包括動作電位閾值(閾電位)、振幅、持續時間、超射、潛伏期、基強度以及在2倍和3倍基強度電流刺激產生的動作電位的數量;被動膜特性包括膜靜息電位、輸入阻抗和膜電容等。

　　三、注意事項

　　首先操作過程中如有轉移液體的，應注意把物鏡調節，不要將溶液濺到顯微鏡頭;不可用手直接接觸探頭銀絲，會損害放大器;實驗前觀察探頭銀絲的鍍銀情況，如銀絲表面已發白，則需鍍銀;地線需要浸沒在液體以下，確保實驗正常開展。

　　四、日常清潔維護

　　實驗結束及時關閉放大器，延長放大器壽命;把顯微鏡光源調至最小后關閉顯微鏡電源;微操的步進馬達關閉之前一定要歸零;保存好所有數據后，關閉軟件和電腦;如實驗中用到加藥管，需要用超純水清洗加藥管與吸水管，否則管道將會被鹽溶液結晶后堵塞。將廢液缸中的液體倒掉，垃圾帶走，使用完畢的玻璃電極，扔進銳器盒;將自己的東西全部收拾好，放回原位;打掃膜片鉗室，以保證實驗室的清潔;膜片鉗室需要配備除濕機，加強房間干燥，防止設備受潮;房間注意防塵，盡量不長時間開窗，保障設備干凈整潔。

　　五、可能常見問題

　　膜片鉗實驗，最棘手的就是排干擾的問題：要防干擾，需要給所有設備設置屏蔽籠和機柜，可以有效地排除外界干擾;還要將屏蔽室內外的各個可能產生電磁干擾的儀器務必都要接地，有的儀器有很多零部件，有些部件之間是絕緣的，要將絕緣的部分分別接地。同一個部件不要重復接地，否則也可能產生干擾。顯微鏡是膜片鉗實驗中很重要的一個組成部分，所以它的排干擾問題也非常重要，我們需要把顯微鏡的燈罩打開，在內部的螺絲上接出一根線，然后在顯微鏡臂上的螺絲上接一根線，可以有效的排除干擾;另外浴槽電極與灌流液一定要接觸良好，不然也會出現干擾的。接地線沒有特殊的要求，只要一般的電線就可以了，實驗過程中，要防止所有實驗液體流到實驗臺或者防震臺上，否則也會產生干擾。排除干擾，是我們正常開展上機實驗的前提，至關重要。

　　我們實驗中可能還會出現放大器超載現象，關于這個問題，我們可以從以下幾個方面檢修：(1)查看電極拉制質量，保證電極沒有斷頭、過粗的現象;(2)檢查放大器探頭和參比電極的銀絲鍍銀情況，要經常鍍銀，并且要保持鍍銀均勻;(3)檢查各個設備接地良好;(4)實驗用細胞外液、電極內液按照規定配方規范配置，液體滲透壓、pH保證在正常范圍，并用濾膜過濾去除雜質細菌;(5)電權入水后適當調節液接電位。

　　六、膜片鉗附屬設備：P-97微電極拉制儀

　　P-97微電極拉制儀是用于Flaming/Brown型微電極、膜片鉗電極、微注射針的拉制器。簡單闡述一下電極拉制過程：打開拉制儀開關，選擇已經設置好參數的拉制通道，選擇enter鍵進入。拿取一根玻璃電極，沿彈簧夾上固定玻璃電極的位置向加熱室推進，并小心準確地將玻璃電極在加熱室的鉑金片中穿過，推到底后，用手固定下面的一側的固定夾把手，旋緊該固定夾旋緊螺母，另一只手推動另外一側固定夾，兩側固定夾緊靠加熱室兩側，確保加熱室兩側玻璃管長度對稱，旋緊另一側固定夾螺母。蓋好拉制儀蓋子，摁PULL按鈕，然后拉制儀即開始加熱拉制程序。拉制儀啟動加熱，加熱到指定HEAT值，鉑金片開始變紅發熱，玻璃管開始融化，伴隨著兩側固定臂的拉力，當拉力達到設定的VEL值，鉑金片停止加熱，并開始吹氣冷卻，吹氣的壓力和時間即為設定的pressure和TIME，在兩臂的持續拉力下，拉開電極。即完成了一次拉制。

　　使用拉制儀需要注意以下幾點：首先安放加熱片要在吹氣孔的正中間，不能和微玻璃管有任何接觸，若加熱片安裝的位置不準確，對電極的準確拉制影響很大。拉制電極都需要先通過RAMP TEST確定HEAT值，再不斷調整PULL、VEL、TIME值，參數要慢慢調試，才可以滿足實驗需要。平時要做好設備的防塵工作，避免觸碰加熱片，定期進行干燥劑更換。

　　電生理膜片鉗設備價格昂貴，設備使用和維護要求也比較高，因此實驗人員務必掌握規范的操作要領，嚴格遵守使用規范，并定期做好設備的清潔維護，才可以保證設備的有效運行以及科研成果的準確性和穩定性。